本發(fā)明屬檢測領(lǐng)域，公開了基于銀納米粒子與Ru(phen)熒光微球間消光作用的免疫層析試紙條，用于快速檢測葡萄酒和葡萄汁中污染的赭曲霉毒素A。以Ru(phen)熒光微球作為熒光背景信號，其最大激發(fā)波長為450nm，將其與OTA檢測抗原混勻噴涂在試紙條檢測區(qū)域；采用SPR吸收峰450nm的球形銀納米粒子與OTA單克隆抗體的復(fù)合物作為消光探針。在陽性樣品檢測時，樣品中游離的OTA與固定在檢測線上的檢測抗原競爭與銀探針結(jié)合，樣品中OTA的含量與結(jié)合在檢測線上銀探針的數(shù)量成反比，而與熒光信號強度成正比。本發(fā)明方法在定性檢測OTA時更靈敏。

1.檢測葡萄酒和葡萄汁中赭曲霉毒素A的免疫層析試紙條，其特征是制備方法為：
（1）Ru(phen)₃²⁺-牛血清白蛋白復(fù)合物的制備：
1）Ru(phen)₃²⁺熒光微球合成：在100 mL乙醇中加入4 mL氨水、2.5 mL水和8 mL正硅酸
乙酯，室溫攪拌0.5 h，加入10 mL濃度為2 mg/mL的Ru(phen)₃²⁺乙醇溶液，室溫攪拌過夜，
8000 轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清，沉淀用乙醇洗滌3次，得到的Ru(phen)₃²⁺熒光微球粒徑55 nm
±5 nm，最大激發(fā)波長450 nm，最大發(fā)射波長590 nm；
2）Ru(phen)₃²⁺熒光微球表面氨基化修飾：用熒光微球質(zhì)量20倍的乙醇、與熒光微球等
質(zhì)量的水和熒光微球質(zhì)量25%的氨水分散熒光微球，室溫下攪拌30 min，然后加入熒光微球
質(zhì)量1.2倍的氨基硅烷，室溫攪拌過夜，8000轉(zhuǎn)離心10 min，沉淀復(fù)溶于水中得氨基修飾熒
光微球；
3）氨基修飾熒光微球與牛血清白蛋白簡稱BSA結(jié)合：25 mL 磷酸鹽緩沖液0.01 M，pH
6.0中，加入20 mg 氨基修飾熒光微球，5 mg BSA，200 μg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳
二亞胺鹽酸鹽簡稱EDC，室溫攪拌45 min后，再加入200 μg EDC，25 mg BSA，室溫攪拌1 h，
8000轉(zhuǎn)離心10 min，沉淀復(fù)溶于2 mL水中，得熒光微球-BSA，4℃保存待用；
（2） OTA檢測抗原的制備：1 mg OTA 溶解于 500 μL無水四氫呋喃中，加入 2 mg N-羥
基琥珀酰亞胺和 4 mg N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺，室溫避光反應(yīng)1h；OTA活化產(chǎn)物經(jīng)氮氣吹
干后溶于 200 μL 二甲基甲酰胺中，緩慢滴加于2 mL BSA溶液中0.13 M NaHCO₃溶液，其中
OTA與BSA摩爾比為15:1；室溫避光反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)入0.01 M、pH 6.0的磷酸鹽緩沖鹽水中透析
72 h，-20℃保存待用；
（3） 銀消光探針合成：
1）銀納米粒子合成：在100 mL體系中調(diào)整檸檬酸鈉SC濃度至5 mM，單寧酸TA0.1 mM，加
熱劇烈攪拌，一開始沸騰，加入1 mL AgNO₃ 25 mM，溶液馬上變成亮黃，得到種子大小約15
nm；合成種子銀后移除19.5 mL反應(yīng)液，在剩余反應(yīng)液中加入16.5 mL水，溫度設(shè)定到90℃，
加入0.5 mL SC 25 mM、1.5 mL TA 2.5 mM和1 mL AgNO₃ 25 mM，補足100 mL體積，待銀粒
子生長30 min后，重復(fù)“移除19.5 mL反應(yīng)液，補加16.5 mL水、0.5 mL SC 25 mM、1.5 mL TA
2.5 mM和1 mL AgNO 25 mM₃，補足100 mL體積，90℃生長30 min”這一過程10次，獲得SPR吸
收峰為450 nm的銀納米粒子，與熒光微球激發(fā)光一致；
2）銀納米粒子與抗OTA單克隆抗體結(jié)合：取1mL銀納米粒子溶液粒子數(shù)10¹¹個，7000轉(zhuǎn)離
心10 min，棄上清；沉淀重懸于1 mL含OTA單抗腹水IgG含量5μg的0.1 M pH 7.5硼酸溶液；
20℃磁力攪拌器上攪動2 h，7000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清；沉淀重懸于含0.1%（w/v）BSA的0.1
M pH 7.5硼酸溶液中，5 min后，7000轉(zhuǎn)離心10 min，沉淀重懸于0.25 mL含0.1%（w/v）BSA的
0.1 M pH 7.5硼酸溶液中，得銀消光探針，4℃保存?zhèn)溆茫?br/>（4）試紙條的組裝：試紙條由濾紙、樣本墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水紙五部分組成；其中，樣
品墊用50 mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水包含1%的BSA，0.5%的吐溫20和0.05%的疊氮鈉浸
潤，并于60℃干燥2 h；結(jié)合墊為玻璃纖維膜，用0.01 M 的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.4，包含
0.2%吐溫20和2%蔗糖浸潤，于60℃干燥4 h，上述銀消光探針稀釋6倍后以1.25 μL/cm噴涂
在結(jié)合墊上，將檢測抗原OTA-BSA 1.2 mg/mL與熒光微球-BSA80 μg/mL混合后噴涂于NC膜
的檢測線，驢抗鼠IgG抗體0.2 mg/mL與熒光微球-BSA80 μg/mL混合后噴涂于NC膜的對照線
質(zhì)控線上，設(shè)置各線噴涂量均為0.75 μL/cm，將噴涂后的NC膜置于37 ℃的真空干燥箱中干
燥6 h；商業(yè)化的濾紙和吸水紙不經(jīng)特殊處理，直接使用；切割成寬度3.8 mm每條，裝入試紙
條卡盒中，然后與干燥劑一起裝入避光袋密封保存待用；試紙條卡盒與常規(guī)的膠體金速測
卡盒相同，內(nèi)有試紙條固定卡槽，在試紙條的濾紙位置留有加樣孔，在Nc膜上檢測線和質(zhì)控
線位置留有檢測窗口；得試紙條；
（5）試紙條使用：
1）定性檢測葡萄酒中OTA：1 體積葡萄酒加入3體積包含40 mM NaHCO₃ 和1% PEG₈₀₀₀的
水溶液，混勻后取出70 μL 加入試紙條加樣孔，20 min后插入激發(fā)光450 nm的試紙條熒光
檢測盒上海互幗科學(xué)儀器有限公司，Micro-F450，如葡萄酒樣品中OTA含量大于等于0.4 μ
g/L，則檢測線出現(xiàn)肉眼可見熒光，即葡萄酒中OTA定性檢測限為0.4 μg/L；
2）定性檢測葡萄汁中OTA：1 體積葡萄汁加入等體積包含40 mM NaHCO₃ 和0.5% PEG₈₀₀₀
的水溶液，混勻后取出70 μL 加入試紙條加樣孔，20 min后插入激發(fā)光450 nm的熒光試紙
條檢測盒中上海互幗科學(xué)儀器有限公司，Micro-F450，如葡萄汁樣品中OTA含量大于等于
0.2 μg/L，則檢測線出現(xiàn)肉眼可見熒光，即葡萄汁中OTA定性檢測限為0.2 μg/L；
3）定量檢測葡萄酒中OTA：在對葡萄酒中OTA含量進行定量檢測時，首先制作標準曲線，
選取一種已知不含OTA的葡萄酒樣品作為陰性基質(zhì)，在8份陰性基質(zhì)中分別摻入不同濃度的
OTA標準物質(zhì)，制成8份梯度加標樣品，分別是：20、10、5、2.5、1.25、1、0.4和0.2 μg/L；上述
各1 體積加標樣品加入3 倍體積包含40 mM NaHCO₃ 和1% PEG₈₀₀₀的水溶液，混勻后取出70
μL 加入試紙條加樣孔，20 min后將試紙條插入激發(fā)光450 nm、發(fā)射光590 nm的熒光讀卡儀
上海互幗科學(xué)儀器有限公司，HG-F450/590，讀取檢測線和質(zhì)控線上熒光值，將二者比值設(shè)
為縱坐標，OTA濃度的對數(shù)值設(shè)為橫坐標，繪制標準曲線，即得到定量檢測的標準方程；將待
檢葡萄酒樣本1體積加入3 倍體積包含40 mM NaHCO₃ 和1% PEG₈₀₀₀的水溶液，混勻后取出70
μL 加入試紙條加樣孔， 20 min后將試紙條插入激發(fā)光450 nm、發(fā)射光590 nm的熒光讀卡
儀上海互幗科學(xué)儀器有限公司，HG-F450/590，讀取檢測線和質(zhì)控線上熒光值，將二者比值
帶入標準方程，即得到樣本中OTA含量；定量檢測葡萄酒中OTA濃度的線性范圍0.4 至20 μ
g/L，最低檢測限0.2 μg/L；
4）定量檢測葡萄汁中OTA：在對葡萄汁中OTA含量進行定量檢測時，首先制作標準曲線，
選取一種已知不含OTA的葡萄汁樣品作為陰性基質(zhì)，在8份陰性基質(zhì)中分別摻入不同濃度的
OTA標準物質(zhì)，制成8份梯度加標樣品，分別是： 10、5、2.5、1.25、1、0.4、0.2和0.1 μg/L；上
述各1 體積加標樣品加入等體積包含40 mM NaHCO₃ 和0.5% PEG₈₀₀₀的水溶液，混勻后取出
70 μL 加入試紙條加樣孔，20 min后將試紙條插入熒光讀卡儀激發(fā)光450 nm，發(fā)射光590
nm，讀取檢測線和質(zhì)控線上熒光值，將二者比值設(shè)為縱坐標，OTA濃度的對數(shù)值設(shè)為橫坐標，
繪制標準曲線，即得到定量檢測的標準方程；將待檢葡萄汁樣本1體積加入等體積包含40
mM NaHCO₃ 和0.5% PEG的水溶液，混勻后取出70 μL 加入試紙條加樣孔，20 min后將試紙
條插入熒光讀卡儀激發(fā)光450 nm，發(fā)射光590 nm，讀取檢測線和質(zhì)控線上熒光值，將二者比
值帶入標準方程，即得到樣本中OTA含量；定量檢測葡萄汁中OTA的濃度范圍0.2 至10 μg/
L，最低檢測限0.1 μg/L。