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一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-07-21
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201310141623.6 
  • 技術(專利)名稱 一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法 
  • 項目單位 上海海洋大學
  • 發明人 李家樂,李西雷,白志毅,汪桂玲,羅紅瑞 
  • 行業類別 其他領域
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 王鰍鋒
  • 發布時間 2021-07-21  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,是將三角帆蚌外套膜組織進行原位雜交,根據外套膜組織原位雜交的結果對目的基因進行基因定位,所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針,所述的目的基因的序列如SEQIDNo.1所示,所述的探針的序列如SEQIDNo.2所示。本發明為三角帆蚌外套膜參與的成殼和育珠研究提供了基因定位的方法,也為進一步研究三角帆蚌生長和育珠過程中各種分子機制提供了一種技術手段。本發明的方法易于操作,節省時間,無需特殊設備,成本較低。本發明對養殖中提高淡水珍珠質量的研究有重要意義。
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  • 02

    說明書

    1.一種三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,是將三角帆蚌外套膜組織進行原位雜交,根據外套膜組織原位雜交的結果對目的基因進行基因定位,其特征在于,所述的外套膜組織原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針,所述的目的基因的序列如SEQ?ID?No.1所示,所述的探針的序列如SEQ?ID?No.2所示。2.根據權利要求1所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的外套膜組織原位雜交包括以下步驟:(1)將三角帆蚌外套膜組織進行固定;(2)將固定好的外套膜組織進行切片;(3)將組織切片進行預處理;(4)將預處理后的組織切片進行雜交;(5)雜交后的處理與檢測。3.根據權利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的步驟(1)是將三角帆蚌外套膜組織用4%多聚甲醛溶液在溫度4℃下固定24?h,然后用DEPC水配制的1×PBS溶液洗滌組織。4.根據權利要求3所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的4%多聚甲醛溶液的溶質為多聚甲醛,溶劑為PBS,多聚甲醛的終濃度質量百分含量為4%,所述的PBS的制備方法為:NaCl?8?g、KCl?0.2?g、Na2HPO4?1.44?g、KH2PO4?0.24g,用DEPC-H2O?配至1?L,調pH值至7.4。5.根據權利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的步驟(2)是將固定后的外套膜組織切成厚度為7~10?μm的組織切片,并將烘烤后的切片保存于4℃冰箱。6.根據權利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,步驟(3)中所述的預處理按照如下步驟進行:(a)將組織切片分別進行第一次二甲苯脫蠟5?min、第二次二甲苯脫蠟5?min、二甲苯和酒精的等量混合液脫蠟5?min;(b)然后依次經過第一次無水乙醇清洗10?min、第二次無水乙醇清洗10?min、95%乙醇清洗5?min、90%乙醇清洗5?min、80%乙醇清洗5?min、70%乙醇清洗5?min、1×PBS溶液清洗10?min;(c)然后再依次經過Triton?X-100清洗10?min、1×PBS溶液清洗10?min、37℃下含5?μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15?min、質量百分含量為0.2%甘氨酸溶液清洗5?min、第一次1×PBS溶液清洗5?min、第二次1×PBS溶液清洗5?min,用4%多聚甲醛溶液滴片固定5?min;(d)固定后再用1×PBS溶液清洗兩次,每次均清洗5?min,組織切片放入55℃去離子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30?min。7.根據權利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,步驟(4)中所述的雜交條件為:雜交液中加入終濃度為1.0?μg/mL的探針,混合均勻,75℃加熱5?min后,冰上急冷,然后將雜交液滴片到組織切片上,于55℃的雜交爐中孵育16~20?h。8.根據權利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的步驟(5)按照如下步驟進行:(a)雜交后的組織切片用甲酰胺和1×SSC的等量混合液于55℃下洗滌兩次,每次均洗滌30?min;(b)組織切片用NTE?Buffer于37℃下洗滌10?min,然后用加有終濃度為20?μg/mL的RNase?A的NTE?Buffer溶液于37℃下洗滌30?min,再用NTE?Buffer于37℃下洗滌10?min;所述的NTE?Buffer的具體成分為:500?mmol/L?NaCl,10?mmol/L?Tris,1?mmol/L?EDTA,pH?8.0。(c)分別用1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于37℃下各洗滌一次,每次均為10?min;(d)用1×PBS溶液于37℃下洗滌切片5?min,再將組織切片浸入Blocking?solution溶液中,室溫浸泡1?h,然后浸入1%?BSA溶液中,室溫浸泡30?min;(e)按1:2000的抗體效價,在Blocking?solution溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體,將組織切片浸入其中,室溫浸泡2?h;(f)將經過抗體孵育后的組織切片用Wash?solution室溫洗滌2次,每次洗滌20?min;(g)再將切片浸入Detection?solution溶液中,室溫浸泡3?min;(h)然后將切片放于NBT/BCIP反應液中避光孵育12~16?h,在此過程中觀察切片呈色強度;(i)當顯色完全后,將切片用1×PBS溶液室溫清洗10?min;(j)最后將切片經過二甲苯脫色,用中性樹脂封片,觀察,拍照。9.根據權利要求1-8中任一所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法,其特征在于,所述的三角帆蚌為健康3齡三角帆蚌。
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專利技術附圖

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