本發明公開了一種基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，將檢測探針固定在檢測陣列上，與PCR擴增的待測基因片段進行雜交，當目的片段被固相載體上的探針識別后，能夠進行核酸序列的合成延長，使得被生物素標記的擴增片段固定在檢測陣列上而不被洗脫，而不能被探針識別的序列，就不能進行序列的延長，不能通過探針被固定，進而被洗脫掉；這樣通過設計多個檢測探針呈矩陣式的分布，一次就可以檢測出待檢測基因位點的突變性質。

1.一種基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因突變檢測方法，
其特征在于，包括以下步驟：
1）針對目的基因的待測區域設計并合成PCR擴增引物對，在擴增引物
的5`端增加生物素標記；提取包含目的基因的基因組DNA，以基因組DNA
為模板，以生物素標記的擴增引物對進行多個循環的PCR擴增，得到PCR
擴增產物，所擴增的片段長度不超過1000bp；
2）針對目的基因待測區域的突變多態性，設計并合成多個長度為15～
25nt的檢測探針，檢測探針上針對檢測突變多態性的位點設置在探針5`端5nt
之后；并在檢測探針5`端進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修
飾；
所述的檢測探針為：
探針1：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-ccttgataat?ccagaagaac?c；
探針2：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-tccaggatca?acaacaacca?gt；
探針3：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-tgactggaga?tttgggact；
探針4：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-cagcaggatg?cagaggaa；
探針5：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-ggtagttgat?gttcctggaa?g；
探針6：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-ccataggaat?cttgcgaaag；
探針7：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-atgttcagcg?cagggt；
探針8：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>-ttccttggag?atacataggg?agga；
3）對固相載體的表面進行修飾后，將檢測探針和對照探針呈矩陣分布的
固定在固相載體上，得到固定有檢測探針和對照探針的檢測陣列；
所述的固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜，將硝酸纖維素膜或尼龍膜在
2×SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃條件下干燥，然后再將檢測探
針和對照探針均勻噴涂在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，經50～80℃干燥30～
120min，紫外光照1～10min后，得到固定有檢測探針和對照探針的硝酸纖
維素或尼龍膜的檢測陣列；
所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均
與待檢測的序列無互補性，陽性對照探針的5`端還被生物素標記；
4）將PCR擴增產物進行變性處理后，置于包含DNA聚合酶和反應底
物的PCR反應液中，然后再加入檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應
程序為：A：在不低于探針Tm值5℃的溫度下退火至少10s；B：72℃延伸
至少10s；A-B循環數至少大于1；最后72℃延伸至少3min；所述的DNA
聚合酶為Taq酶；
5）固相核酸擴增完成后，取出檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非
特異核酸的結合，用含親和素-堿性磷酸酶的反應液覆蓋檢測陣列并進行孵
育，再次洗脫后用ddH₂O沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色液進行顯
色，直至看到顯色斑點后用ddH₂O終止反應；
6）顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域相匹
配，未顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域不相
匹配；根據設計的檢測探針及其陣列上的檢測位點設計情況，對待測區域的
突變多態性進行判讀。
2.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的以基因組DNA為模板的PCR擴增，擴
增循環數為25～40。
3.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載
玻片，檢測探針5`端的輔助固定修飾為在檢測探針5`最末端添加氨基、巰基、
羥基或醛基。
4.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的檢測陣列在使用前還在體積濃度為2%～
5%的BSA中37℃封閉至少15min。
5.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的變性處理為熱變性處理：95℃以上至少
放置5min，再在0℃至少放置3min；
或者，所述的變性處理為堿變性處理：將質量濃度10%的NaOH溶液與
PCR擴增產物按照1:10～20的體積比混合，放置至少3min。
6.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的進行固相核酸擴增反應，其反應體系為
40～200μl，包括變性處理后的PCR擴增產物，含DNA聚合酶、反應底物和
Mg²⁺的PCR反應液，以及ddH₂O；加入的檢測陣列浸沒于反應體系內。
7.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的非疾病的診斷的基因
突變檢測方法，其特征在于，所述的固相核酸擴增反應完成后，取出檢測陣
列首先放入洗脫液A中，轉速至少30rpm離心洗脫至少1min；然后將檢測
陣列覆蓋親和素反應液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脫液A、洗
脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少1min；取出檢測陣列用ddH₂O沖
洗，最后覆蓋顯色液進行顯色，至看到顯色斑點后終止反應；
所述的洗脫液A的組成為100mmol/L?pH=7.5的Tris-Cl、300mmol/L?NaCl
和4mmol/L?Mg₂Cl；洗脫液B的組成為100mmol/L?pH=9.5的Tris-Cl、
300mmol/L?NaCl和4mmol/L?Mg₂Cl；
所述的親和素反應液組成為1mL?ddH₂O和2μl親和素-堿性磷酸酶液；
顯色反應液組成為1mL顯色緩沖液、6.5μlNBT合3.5μl?BCIP。