本發(fā)明是有關(guān)于一種檢測探針、通用寡核苷酸芯片及核酸檢測方法及其用途。通過設(shè)計(jì)線性檢測探針對P1和P2實(shí)現(xiàn)對核酸樣本上待測堿基或突變位點(diǎn)的高通量檢測。將檢測探針與核酸樣本退火雜交，之后將其均分成四個反應(yīng)體系，在每個體系中分別加入A，T，G，C，在DNA聚合酶和連接酶的作用下，將相應(yīng)的檢測探針對P1和P2連接成為一條探針，將此探針進(jìn)行純化和擴(kuò)增后，與通用寡核苷酸微陣列上的對應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雜交，最后對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測和分析，確定核酸樣本上待測位點(diǎn)堿基類型或突變位點(diǎn)基因型。本發(fā)明可應(yīng)用于對目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測序分析、對已知核酸序列中的突變位點(diǎn)，插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析及病原微生物的分型檢測領(lǐng)域，具有低成本、高特異性、高靈敏度的效果。

1.一種核酸檢測方法，應(yīng)用于包括對目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測序分析、對已知核酸序列
中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析在內(nèi)的非疾病診斷治療目的，其中核酸序列
中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)差異為單個核苷酸殘基，或者為多個核苷酸殘基但所述多
個核苷酸殘基為連續(xù)的相同的核苷酸殘基；其特征在于其包括以下步驟：
①待測核酸樣本的制備；
②檢測探針的制備，所述檢測探針是由針對各個待測位點(diǎn)的檢測探針對P1、P2組成，且
所述檢測探針對P1、P2分別含有一條核苷酸序列H1、H2,且H1、H2序列和緊鄰待測堿基位點(diǎn)
兩側(cè)的序列互補(bǔ)；檢測探針對P1、P2還各含有一條通用寡核苷酸序列H3、H4，H3序列和H4序
列的互補(bǔ)序列作為一對通用引物的序列用來對檢測探針對進(jìn)行擴(kuò)增；且在該檢測探針對上
至少還含有一個用于與檢測芯片上特定位點(diǎn)進(jìn)行雜交和識別的Tag序列，且該Tag序列位于
檢測探針P1或P2中間部分，也即H1與H3、或H2與H4的中間部分；
③將各檢測探針對與核酸樣本退火雜交，在各檢測探針對間形成與待測堿基位點(diǎn)處的
堿基相對應(yīng)的缺口；
④將退火后的反應(yīng)體系均分成A、T、G、C四個反應(yīng)體系，在A體系中加入dATP，在T體系中
加入dTTP，在G體系中加入dGTP，在C體系中加入dCTP，在DNA聚合酶和連接酶的作用下，與待
測堿基位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ)的堿基就會填充上述缺口，將各檢測探針對連接成為一條檢測探
針；
⑤純化上述連接的檢測探針；
⑥擴(kuò)增純化出的檢測探針；
⑦通用寡核苷酸芯片的制備，將每張芯片分成A,T,G,C四個雜交區(qū)域，每個區(qū)域在檢測
探針對P1、P2間形成與待測堿基位點(diǎn)處的堿基相對應(yīng)的各個位點(diǎn)上分別點(diǎn)制與對應(yīng)的檢測
探針上的Tag序列相同的寡核苷酸序列；
⑧將上述寡核苷酸芯片的A,T,G,C四個雜交區(qū)域用來分別和擴(kuò)增后對應(yīng)的四個反應(yīng)體
系中的檢測探針進(jìn)行雜交；
⑨對芯片進(jìn)行結(jié)果檢測分析。
2.一種核酸檢測方法，應(yīng)用于包括對目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測序分析、對已知核酸序列
中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析在內(nèi)的非疾病診斷治療目的；其特征在于：采
用權(quán)利要求1所述的核酸檢測方法，其中所述的各檢測探針對的制備步驟中，還包括另一條
檢測探針P2’，由探針P1和P2’對插入型模板進(jìn)行分型檢測，由探針P1和P2對缺失型模板進(jìn)
行分型檢測；該檢測探針P2’含有一條核苷酸序列H1或H2，且H1或H2序列和緊鄰待測堿基位
點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)；檢測探針P2’還含有一條通用寡核苷酸序列H3或H4，H3序列和H4序列的
互補(bǔ)序列作為一對通用引物的序列用來對檢測探針對進(jìn)行擴(kuò)增；檢測探針P2’還含有一個
用于與檢測芯片上特定位點(diǎn)進(jìn)行雜交和識別的Tag序列及與待測樣本插入型多態(tài)性位點(diǎn)的
插入序列互補(bǔ)的序列H5，且該Tag序列位于H1與H3、或H2與H4的中間部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的待測核酸樣本為動
植物染色體DNA、目標(biāo)核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、線粒體DNA、cDNA、細(xì)菌或者病毒DNA或RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的檢測探針對中檢測
探針的不發(fā)生連接反應(yīng)的一端至少還含有生物素標(biāo)記分子，且該生物素標(biāo)記分子與檢測探
針的核苷酸序列之間還含有一段連接臂，有利于后續(xù)的檢測探針純化和擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的連接臂為碳連接臂、聚
乙二醇、polyA或polyT。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的檢測探針的純化步
驟是采用鏈親和素包被載體介質(zhì)來完成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的載體介質(zhì)為磁性微粒
或聚苯乙烯微球。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的檢測探針的擴(kuò)增步
驟是利用與所述各檢測探針對上的通用寡核苷酸序列H3，H4對應(yīng)的通用引物進(jìn)行的對稱或
不對稱PCR擴(kuò)增。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的對稱PCR擴(kuò)增，至少在
一條通用引物的5’端還含有分子標(biāo)記；其中所述的不對稱PCR擴(kuò)增，至少有一條為限制性通
用引物，另一條為非限制性通用引物，且在非限制性通用引物的5’端至少還含有分子標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的分子標(biāo)記為非同位素
標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的非同位素標(biāo)記為熒
光素分子,金屬標(biāo)記，半抗原標(biāo)記或酶類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的熒光素分子為cy3,
cy5,FITC，金屬標(biāo)記為Hg，半抗原標(biāo)記為地高辛，酶類為辣根過氧化物酶HRP，半乳糖苷酶，
堿性磷酸酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的對芯片進(jìn)行結(jié)
果檢測分析的步驟是對芯片進(jìn)行單色熒光掃描并根據(jù)芯片上四個分區(qū)對應(yīng)位點(diǎn)上的熒光
信號出現(xiàn)情況確定檢測結(jié)果，或者對芯片進(jìn)行酶顯色的方法確定檢測結(jié)果。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸檢測方法，其特征在于其中所述的放射性同位素標(biāo)記
為³²P或³⁵S。