本發(fā)明公開(kāi)了一種凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂的制備方法。首先稱(chēng)取保存的瓊脂糖凝膠進(jìn)行洗滌處理，然后采用環(huán)氧氯丙烷活化法進(jìn)行活化凝膠，得到活化凝膠；將得到的活化凝膠與間隔臂分子N?羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行手臂連接反應(yīng)，得到手臂連接的凝膠；將得到手臂連接的凝膠與肽配基進(jìn)行配基偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物進(jìn)行處理反應(yīng)得到凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂；所得樹(shù)脂進(jìn)行洗滌處理，最后于凝膠體積3倍的20％乙醇溶液中在4℃條件下存放。將本發(fā)明產(chǎn)品層析樹(shù)脂用于從血漿中提取凝血因子Ⅷ，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子Ⅷ。

1.一種凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步
驟：
a、首先稱(chēng)取保存于冰箱中20％乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖
凝膠CL-6B，采用過(guò)量蒸餾水進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝
膠；
b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
稱(chēng)取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1～0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體
積量是濕瓊脂糖凝膠重量的3～5倍；然后在25～35℃條件下恒溫震蕩0.5～2h，恒溫震蕩時(shí)
振動(dòng)速度為100～200轉(zhuǎn)/min；
震蕩后取出凝膠進(jìn)行充分水洗，水洗后進(jìn)行真空抽濾，然后加入到1mol/L的NaOH溶液
中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3～5倍；然后在20～30℃、180～220轉(zhuǎn)/分條
件下恒溫振蕩30～40分鐘；震蕩后靜置30～40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50％的二甲基亞礬或占沉淀凝膠體積百分
比50％的1,4-二氧六環(huán)為活化溶劑，并加入占沉淀凝膠體積百分比20％的環(huán)氧氯丙烷，在
25～35℃、180～220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩反應(yīng)9～12h；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，
抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復(fù)洗滌至濾液為中性，洗滌后進(jìn)行抽濾，得到活化凝膠；
c、手臂連接：
將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度為
9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5～8，所述
碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍；然后在55～65℃、180～220轉(zhuǎn)/分條件下
恒溫振蕩1～1.5h，進(jìn)行“手臂”分子鍵合反應(yīng)；反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
稱(chēng)取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾數(shù)的
肽配基及碳化二亞胺EDC，在25～35℃、180～220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩進(jìn)行配基偶聯(lián)反應(yīng)
1.5～2.5h；
所述肽配基為肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一
種；
e、稱(chēng)取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的1mol/L的醋酸水溶液，
在25～35℃、100～200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2～2.5h；震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液
體抽濾后，采用去離子水洗滌3～4次；每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積；洗滌后
加入濕凝膠體積1/2的1mol/L的乙醇胺，接著在25～35℃、100～200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩
反應(yīng)2～2.5h；所得產(chǎn)物即為凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂；
f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20％乙醇溶液沖洗3～4次，每次加入
的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積；沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20％乙醇溶液
中在4℃條件下存放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂的制備方法，其特征在于：步驟a中
所述瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖凝膠CL-6B由瓊脂糖凝膠微球或葡聚糖凝膠微
球替代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂的制備方法，其特征在于：所述肽配
基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常規(guī)多肽合成方法制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子Ⅷ親和層析樹(shù)脂的制備方法，其特征在于：所述肽配
基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的純度均≥95％。