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小鼠脂聯素基因超表達載體的構建及用途

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-07-02
  • 技術成熟度:通過中試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201110088270.9 
  • 技術(專利)名稱 小鼠脂聯素基因超表達載體的構建及用途 
  • 項目單位 浙江大學
  • 發明人 向蘭,汪以真,戚建華,黃艷娜 
  • 行業類別 中藥材獲取-動植物采集
  • 技術成熟度 通過中試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 鄭尤銘
  • 發布時間 2021-07-02  
  • 01

    項目簡介

    本發明提供一種小鼠脂聯素基因超表達載體的構建方法,通過將RT-PCR技術克隆得到的小鼠脂聯素片段并連接到pTarget哺乳動物表達載體系統上,轉化大腸桿菌DH5α,構建得到pTarget/ADP超表達載體的重組質粒,構建好的pTarget/ADP超表達載體對ADP具有很好的增強基因表達量的效果。本發明開拓了目前研究動物脂肪代謝調控和基因功能研究的思路。所用的超表達載體方便易得,載體構建方法簡單、可行,能夠特異、高效地增強ADP基因的表達,可在制備治療肥胖及代謝性綜合癥藥物中的應用。或在建立動物模型進行ADP對糖和脂肪代謝的調節及肌纖維生長,發育的影響研究中的應用。
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  • 02

    說明書

    1.一種小鼠脂聯素基因超表達載體的構建方法,其特征在于,通過以下步驟實現:(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪組織中的RNA,反轉錄為cDNA,得到小鼠脂聯素?DNA片段,序列如SEQ?ID?NO:1所示;(2)RT-PCR?擴增:以(1)得到的cDNA為模板,上下游引物為,SEQ?ID?NO:2??5'-ATGCTACTGTTGCAAGCTCT-3'?SEQ?ID?NO:3??5'-TCAGTTGGTATCATGGTAGA-3'用pfu?DNA聚合酶進行PCR反應,擴增條件為93℃、3分鐘預變性后,94℃50?秒、56℃45秒-2分鐘、72℃30秒共30個循環,最后1輪循環完成后再72℃延伸10?分鐘,反應完畢后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果;(3)表達載體構建:將回收的目的DNA片段連至pTarget載體,轉化大腸桿菌-TOP10感受態細胞中,涂布含100mg/mL氨芐西林的LB平板上,過夜培養,挑取單菌落至含有同樣濃度Amp的液體培養液中,抽提質粒,用EcoRI酶切質粒,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2.根據權利要求1所述方法構建的一種小鼠脂聯素基因超表達載體在制備治療肥胖及代謝性綜合癥藥物中的應用。3.?根據權利要求1所述方法構建的一種小鼠脂聯素基因超表達載體在建立動物模型進行脂聯素對糖和脂肪代謝的調節及肌纖維生長?、發育的影響研究中的應用。4.根據權利要求2或3所述的應用,其特征在于,所述用途通過以下步驟實現:(1)將含小鼠脂聯素超表達載體的大腸桿菌擴大培養后,利用去內毒素試劑盒提取高純轉染級質粒;(2)將含小鼠脂聯素超表達載體的高純轉染級質粒進行小鼠體內流體效應法超表達實驗,流體效應法參數為:質粒15ug,尾靜脈注射超表達載體體積:0.1ml/體重,時間為10秒;(3)小鼠尾靜脈注射超表達載體,1天后,分析pTarget/脂聯素超表達載體對脂肪代謝關鍵功能基因ATGL、HSL、LPL、SIRT1、PGC-1α、FOXO3a基因表達的影響,1周后,同樣分析對脂肪和肌肉上述脂肪代謝關鍵功能基因ATGL、HSL、LPL、SIRT1、PGC-1α、FOXO3a,以及肌肉中肌纖維分型MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx基因表達的影響,研究脂聯素的功能。
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專利技術附圖

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