本發明涉及一種AS-PCR引物設計方法、基因多態性檢測方法及試劑盒，所述方法及試劑盒用于對可能包含等位基因變異區域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在。所述AS-PCR引物設計方法包括以下步驟：（i）針對包含待測等位基因變異區域的靶序列設計AS-PCR引物；（ii）對步驟（i）所設計的AS-PCR引物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團。相較于傳統AS-PCR單一的檢測位點能力，本發明的基因多態性引物設計方法和檢測方法及試劑盒可以模糊識別突變位點,并且可以將探針和引物合二為一,節約了引物合成成本、設計時間，設計也方便易懂，容易掌握。

1.一種AS-PCR引物的設計方法，所述方法包括以下步驟：
(i)針對包含待測等位基因變異區域的靶序列設計AS-PCR引物；
(ii)對步驟(i)所設計的AS-PCR引物進行修飾，使所述AS-PCR引物
的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團，
其中，步驟(ii)獲得的經修飾的AS-PCR引物用于使用B型DNA聚合
酶進行的PCR反應，使得所述經修飾的AS-PCR引物在與模板鏈錯配時延伸，
而與模板鏈互補時不延伸，
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活
性，還具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。
2.一種AS-PCR基因多態性檢測方法，所述方法用于對可能包含等位基
因變異區域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在，其特征在于所述
方法包括以下步驟：
(i)針對所述可能包含等位基因變異區域的靶序列設計AS-PCR引物；
(ii)對步驟(i)所設計的AS-PCR引物進行修飾，使所述AS-PCR引物
的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團；
(iii)使用步驟(ii)獲得的經修飾的AS-PCR引物對所述靶序列進行PCR
擴增，所述PCR擴增使用B型DNA聚合酶；
(iv)分析步驟(iii)的擴增結果確定所述等位基因變體是否存在，
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活
性，還具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(i)中所述等位基因變異
區域位于所述AS-PCR引物的3’端的第1～6個堿基中，所述引物的長度為
18bp～30bp。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中使在擴增反應中所述AS-PCR
引物的5’端到所述等位基因變異區域的Tm值為48℃～52℃。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(ii)對所述AS-PCR引物
的3’端的修飾包括脫羥基、羥基位置修飾氨基、羥基位置修飾羧基、羥基位
置修飾巰基或羥基位置修飾磷酸基。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(ii)對所述AS-PCR引物
的3’端的修飾為標記熒光淬滅基團，并且步驟(ii)進一步包括對所述AS-PCR
引物的5’端標記熒光基團。
7.根據權利要求6所述的方法，其中標記所述AS-PCR引物5’端的所述
熒光基團選自下列物質所構成的組：FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas?Red或
CY5，標記所述AS-PCR引物3’端的所述熒光淬滅基團選自下列物質所構成的
組：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse。
8.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述B型DNA聚合酶為pfu?DNA
聚合酶或KOD?DNA聚合酶。
9.一種AS-PCR基因多態性檢測試劑盒，其中至少包含以下成分：
a.根據權利要求2至8中任一項所述的方法步驟(i)-(ii)所設計的AS-PCR
引物；
b.根據權利要求2至8中任一項所述的方法步驟(iii)中使用的B型DNA
聚合酶；
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活
性，還具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。