本發明公開了一種鯊魚蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途，該抗氧化肽的氨基酸序列為Leu-Asp-Lys，ESI-MS檢測給出分子離子峰分子量m/z 375.30[M+H]，制備時以脫脂鯊魚魚肉作為原料，按固液比1g:15mL~20mL加入緩沖液，用0.05~0.15mol/L HCl或0.05~0.15mol/L NaOH調節pH到5.0~7.0，得混合液；將混合液溫度升至50℃~60℃攪拌預熱5min~10min，按照脫脂魚肉質量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為50℃~60℃，酶解時間1h~3h，得酶解產物；將酶解產物先經滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。本發明制備工藝科學合理，酶解過程易監控，制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等應用。

1.一種鯊魚蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
1)以脫脂鯊魚魚肉作為原料，按固液比1g∶15mL～20mL加入緩沖液，用HCl或
NaOH調節pH到5.0～7.0，得混合液；所述脫脂鯊魚魚肉的制備過程為：將洗凈、去
骨和皮的鯊魚肉按照固液比1g∶1mL～2mL放入緩沖液中，用高速組織搗碎機將其處
理成勻漿，然后按照體積比1∶2～4放入乙醚中脫脂20～25h，3～5℃、4000～5000rpm，
10～15min離心除去乙醚，收集固形物即得到脫脂鯊魚魚肉；鯊魚為路氏雙髻鯊；
2)將混合液溫度升至50℃～60℃攪拌預熱5min～10min，按照脫脂魚肉質量
的0.8％～1.2％加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶U/g，酶解溫度為50℃
～60℃，酶解時間1h～3h，得酶解產物；
3)將得到的酶解產物先經滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次經脫鹽、超濾和層
析，得到抗氧化肽；
所述滅酶處理為：將酶解產物升溫至90℃～95℃，并于此溫度保持10min～15min
后，冷卻至15℃～20℃，然后離心，得酶解液；
所述脫鹽、超濾和層析的具體過程為：
脫鹽：將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL～20mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層
析柱進行脫鹽，然后用質量濃度45～55％乙醇進行解析，40℃以下低壓旋蒸除去乙醇，
濃縮液進行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；
超濾：將脫鹽后的酶解物干粉溶于pH?5.5～6.5的磷酸鹽緩沖液配成8～12mg/mL的
溶液，于0.1～0.15MPa的工作壓力和20～25℃的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處
理，收集分子量小于1kDa部分，得超濾酶解液；
層析：將上述超濾酶解液用pH?5.5～6.5的磷酸鹽緩沖液配成8～12mg/mL的溶液，
經過陰離子交換樹脂分離，用水、0.09～0.11mol/L、0.45～0.55mol/L和0.9～1.1mol/L?NaCl
溶液進行洗脫，收集280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活
性最高組分為離子交換酶解液；將所述離子交換酶解液用pH?5.5～6.5磷酸鹽緩沖液配成
8～12mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集280nm下
的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠制備酶解物，
將上述凝膠制備酶解物用pH?5.8～6.2磷酸鹽緩沖液配成45～55μg/mL的溶液，利用反相
高效液相色譜RP-HPLC進行純化，根據抗氧化活性得1個高活性抗氧化肽Leu-Asp-Lys；
所述大孔樹脂為D101；
所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-25；所述反相
高效液相色譜條件為：進樣量19～21μg；色譜柱為Zorbax?C18；柱溫為室溫；流動相：
A含0.1％三氟乙酸的水和B含0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度洗脫：0-55min乙腈濃度從
0至50％，每5min增加5％；洗脫速度1.0ml/min；紫外檢測波長280nm。