本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α?酮基丁酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)α?酮基丁酸具有較高的生產(chǎn)效率，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述基因工程菌是對大腸桿菌Escherichia coli MG1655進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為過表達的蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA、敲除乙酰羥基酸合成酶Ⅰ大亞基編碼基因ilvB、乙酰羥基酸合成酶Ⅲ大亞基編碼基因ilvI以及蘇氨酸操縱子前導(dǎo)肽編碼基因thrL。使用該菌采用發(fā)酵法生產(chǎn)α?酮基丁酸能夠克服化學(xué)合成法、酶法或微生物轉(zhuǎn)化法存在的反應(yīng)條件復(fù)雜、能耗大、污染重或生產(chǎn)成本高污染大等不足，在發(fā)酵20?24h后，α?酮基丁酸產(chǎn)量達到8.5?15.7g/L，該發(fā)酵過程為好氧發(fā)酵，菌體生長快，發(fā)酵周期短，產(chǎn)酸速率高，目前未見直接發(fā)酵法生產(chǎn)α?酮基丁酸的報道。

1.一種基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)α-酮基丁酸中的應(yīng)用，其特征在于，所述基因工程菌，是
對出發(fā)菌株大腸桿菌(Escherichia coli)MG1655進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工
程改造為過表達蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA，并敲除乙酰羥基酸合成酶Ⅰ大亞基編碼基因
ilvB、乙酰羥基酸合成酶Ⅲ大亞基編碼基因ilvI及以及蘇氨酸操縱子前導(dǎo)肽編碼基因
thrL；
所述應(yīng)用包括以下步驟：
①種子培養(yǎng)：將所述的基因工程菌經(jīng)活化后接種至裝有1L種子培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐，流
加25％的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，溶氧維持在30-50％，通風(fēng)量3-5m³/h，攪拌轉(zhuǎn)速
200-600rpm，32-37℃培養(yǎng)6-8h；
②發(fā)酵罐發(fā)酵：以5％-10％接種量將步驟①的種子培養(yǎng)物接至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的
10L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度32-37℃，通風(fēng)量3-5m³/h，攪拌轉(zhuǎn)速300-1000rpm，溶氧
維持在30-60％，流加濃度為60-80％的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)菨舛葹?.1-0.5％(W/V)，流加
25％的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，發(fā)酵周期20-24h；
③發(fā)酵液中α-酮基丁酸的檢測：發(fā)酵液經(jīng)8000×g離心10min后取上清液并用去離子水
稀釋5倍后，采用UltiMate 3000Thermo Scientific高效液相色譜儀測定α-酮基丁酸的含
量；
檢測條件為：色譜柱REzex RoA-organic Acid H+，流動相5mmol/L H₂SO₄，流速0.5mL/
min，柱溫30℃，檢測波長215nm，進樣量為20μL；
所述種子培養(yǎng)基成分為：蔗糖15-25g/L，玉米漿15-25mL/L，酵母粉1-4g/L，(NH₄)₂SO₄1-
4g/L，KH₂PO₄ 0.5-1.5g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01-0.05g/L，MnSO₄·
H₂O0.010.05g/L，pH 7.0，0.075MPa高壓蒸汽滅菌15min；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖15-45g/L，酵母粉1-2g/L，豆餅水解液5-15mL/L，玉米
漿5-15mL/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，檸檬酸0.5-2g/L，MgSO₄ 0.5-1g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L，
MnSO₄·H₂O 0.1-0.5g/L，pH 7.0，0.075MPa高壓蒸汽滅菌15min。
2.一種基因工程菌，是對出發(fā)菌株大腸桿菌(Escherichia coli)MG1655進行基因工程
改造獲得的菌；所述基因工程改造為過表達蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA，并敲除乙酰羥基
酸合成酶Ⅰ大亞基編碼基因ilvB、乙酰羥基酸合成酶Ⅲ大亞基編碼基因ilvI及以及蘇氨酸
操縱子前導(dǎo)肽編碼基因thrL；
所述的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，步驟如下：
(1)種子培養(yǎng)：將所述的基因工程菌活化后，接種至裝有1L種子培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐，流
加25％W/V的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，溶氧維持在30-50％，通風(fēng)量3-5m³/h，攪拌轉(zhuǎn)速
200-600rpm，32-37℃培養(yǎng)6-8h；
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵：以5％-10％接種量將步驟(1)的種子培養(yǎng)物接至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的
10L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度32-37℃，通風(fēng)量3-5m³/h，攪拌轉(zhuǎn)速300-1000rpm，溶氧
維持在30-60％，流加濃度為60-80％W/V的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)菨舛葹?.1-0.5％W/V，流
加25％W/V的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.8-7.2，發(fā)酵周期20-24h；
所述種子培養(yǎng)基成分為：蔗糖15-25g/L，玉米漿15-25mL/L，酵母粉1-4g/L，(NH₄)₂SO₄1-
4，KH₂PO₄ 0.5-1.5g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01-0.05g/L，MnSO₄·
H₂O0.010.05g/L，pH 7.0，0.075MPa高壓蒸汽滅菌15min；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖15-45g/L，酵母粉1-2g/L，豆餅水解液5-15mL/L，玉米
漿5-15mL/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，檸檬酸0.5-2g/L，MgSO₄ 0.5-1g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L，
MnSO₄·H₂O 0.1-0.5g/L，pH 7.0，0.075MPa高壓蒸汽滅菌15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：所述蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA來
自大腸桿菌E.coli MG1655，GeneID:948287，核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：所述乙酰羥基酸合成酶Ⅰ大亞基編
碼基因ilvB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2，所述乙酰羥基酸合成酶Ⅲ大亞基編碼
基因ilvI的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3，所述蘇氨酸操縱子前導(dǎo)肽編碼基因thrL
的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求2所述的基因工程菌的方法，包括如下步驟：
(一)ilvB基因的敲除
(1)采用PCR技術(shù)以大腸桿菌MG1655基因組為模板，根據(jù)MG1655中ilvB(GeneID:
948181)基因5’和3’端400bp序列設(shè)計同源臂引物，擴增獲取ilvB基因的上下游同源臂；
(2)采用PCR技術(shù)以pKD3質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物，擴增氯霉素抗性基因盒片段；
(3)以步驟(1)、(2)獲得的擴增片段為模板通過重疊PCR獲得ilvB基因敲除片段，所述
基因敲除片段由乙酰羥基酸合成酶Ⅰ大亞基編碼基因ilvB的上、下游同源臂基因片段以及
氯霉素抗性基因盒片段組成；
(4)將上述基因敲除片段導(dǎo)入含有pKD46質(zhì)粒的出發(fā)菌株感受態(tài)細胞中，獲得陽性轉(zhuǎn)化
子，消除陽性轉(zhuǎn)化子中的氯霉素抗性基因后獲得ilvB基因敲除菌；
(二)ilvI基因的敲除
(1)以步驟(一)中(1)-(3)相同的方法構(gòu)建ilvI(GeneID:947267)基因敲除片段，所述
ilvI基因敲除片段由ilvI的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段組成；
(2)將(二)-(1)中的基因敲除片段導(dǎo)入含有pKD46質(zhì)粒的ilvB基因敲除菌感受態(tài)細胞
中獲得陽性轉(zhuǎn)化子，消除陽性轉(zhuǎn)化子中的氯霉素抗性基因后獲得ilvB、ilvI基因敲除菌；
(三)thrL基因的敲除
(1)以步驟(一)中(1)-(3)相同的方法構(gòu)建thrL(GeneID:948283)基因敲除片段；
(2)將(三)-(1)中的基因敲除片段導(dǎo)入含有pKD46質(zhì)粒的ilvB、ilvI基因敲除菌感受態(tài)
細胞中獲得陽性轉(zhuǎn)化子，消除陽性轉(zhuǎn)化子中的氯霉素抗性基因后獲得ilvB、ilvI、thrL基因
敲除菌；
(四)ilvA基因的過表達
將ilvA基因及其表達載體pWSK29用Xba I和BamH I進行雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
至上述ilvB、ilvI、thrL基因敲除菌，通過菌落PCR鑒定獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為所述的基因
工程菌。